SAINT-BIO/尚宝生物 BA1943 α-甘露糖苷酶（α-man）活性检测试剂盒（微量法）

α-甘露糖苷酶（α-man）活性检测试剂盒（微量法） 产品货号：BA1943 产品规格：100T/48S 产品简介： α-man分布广泛、种类繁多，在真核生物胞质、内质网、高尔基体、溶酶体中都有发现，不同种类、功能的α-man 共同参与N-聚糖的修饰过程。 α-man和特定底物发生反应，其生成物在405nm处有特征吸收峰，根据吸光度的变化率可计算出α-man活性。 注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增 加样本量进行检测。 产品组成： 试剂名称 规格 保存条件 提取液 液体110mL×1瓶 2-8℃ 试剂一 液体15mL×1瓶 2-8℃ 试剂二 粉剂×2支 -20℃ 试剂三 液体8mL×1瓶 2-8℃ 试剂四 1.5mL×1支 2-8℃ 标准品 液体1mL×1支 2-8℃ 溶液的配制： 1. 试剂二：临用前每支加入0.5mL试剂四溶解，溶解后的试剂在-20℃分装保存，可以保存4周。 2. 标准品：5mmol/L的对硝基苯酚标准液。 需自备的仪器和用品： 紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、恒温培养箱/水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、匀浆 器/研钵、冰和蒸馏水。 操作步骤： 一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献） 1. 组织：按照组织质量（g）︰提取液体积(mL)为1︰5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进 行冰浴匀浆，然后12000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 2. 细胞或细菌：先收集细胞或细菌到离心管内，离心后弃上清；按照细胞或细菌数量（10 4个）：提取液体积（mL） 为500~1000︰1的比例（建议500万个细胞或细菌加入1mL提取液）进行提取，冰浴超声波破碎细胞或细菌（功 率200W，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后12000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 3. 液体：直接检测。若有浑浊可以离心后测定。 二、测定步骤 1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至405nm，分光光度计蒸馏水调零。 2. 将5mmol/L的对-硝基苯酚标准液用蒸馏水稀释为0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.0195、0.01mmol/L 的标准溶液备用。 3. 操作表：(在1.5mL离心管或者96孔板中)： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 标准管 空白管 样本 25 25 - - 试剂一 110 125 125 125 试剂二 15 - - - 标准溶液 - - 25 - 蒸馏水 - - - 25 混匀，37℃水浴或恒温培养箱中准确反应10min 试剂三 250 250 250 250 混匀，吸取200µL于微量玻璃比色皿或96孔板中，测定405nm处吸光值A，分别记为A 对照管、A测定管、A标准管、A空白管。计算ΔA=A测定管-A对照管，ΔA标准=A 标准管-A空白管。每个测定管需设一个对照管，标准曲线、空白管只需检测1-2次。 三、α-甘露糖苷酶(α-man)活性计算 1. 标准曲线的绘制： 以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y＝kx+b，将ΔA带入方 程得到x（mmol/L，即 μmol/mL）。 2. α-甘露糖苷酶活性的计算： （1）按蛋白浓度计算 酶活定义：每mg蛋白每分钟产生1μmol对-硝基苯酚为1个酶活力单位。 α-甘露糖苷酶酶活（U/mg prot）= x×V样÷（V样×Cpr）÷T×F= x×0.1÷ Cpr ×F （2）按样本质量计算 酶活定义：每g样本每分钟产生1μmol对-硝基苯酚为1个酶活力单位。 α-甘露糖苷酶酶活（U/g 质量）= x×V样÷（W×V样÷V提取）÷T×F= x×0.1÷W×F （3）按照细胞或细菌数量计算 酶活定义：每10 4个细胞每分钟产生1μmol对-硝基苯酚为1个酶活力单位。 α-甘露糖苷酶酶活（U/10 4cell）= x×V样÷（细胞数量×V样÷V提取）÷细胞数量（万个）÷T×F = x×0.1÷细胞数量（万个）×F （4）按液体体积计算 酶活定义：每mL样本每分钟产生1μmol对-硝基苯酚为1个酶活力单位。 α-甘露糖苷酶酶活（U/mL）＝x×V样÷V样÷T×F= x×0.1×F V提取：提取液体积，1mL；V样：加入的样本体积，0.025mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行 测定；W：样本质量，g；T：反应时间，10min； F：稀释倍数。 注意事项： 如果测定吸光值A＞1.5或ΔA＞1，建议稀释样本后再测定，计算公式中乘以稀释倍数；如果测定吸光值较低 或接近空白OD值，建议增加样本量后再进行测定。 实验实例： 1. 称取0.1g兔子肝脏组织，加入1mL提取液，冰浴匀浆，12000 g，4℃条件下离心10min；取上清置于冰上待测。 使用96孔板按照测定步骤操作，计算ΔA=A测定管-A对照管=0.404-0.309=0.095，标准曲线y=1.3642x+ 0.0037， 计算x=0.0669，按公式计算活性： α-甘露糖苷酶酶活（U/g 质量）= x×0.1÷W×F = 0.0669U/g质量 2. 称取0.1g绿萝叶片，加入1mL提取液，冰浴匀浆，12000g，4℃条件下离心10min；取上清置于冰上待测。使用 96孔板按照测定步骤操作，计算ΔA=A测定管-A对照管=0.179-0.159=0.02，标准曲线y=1.3642x+ 0.0037，计算 x=0.0119，按公式计算活性： α-甘露糖苷酶酶活（U/g 质量）= x×0.1÷W×F = 0.0119 U/g质量 3. 用0.025mL牛血清按操作步骤进行实验，使用96孔板按照测定步骤操作，计算ΔA=A测定管-A对照管=0.107- 0.086=0.021，标准曲线y=1.3642x+ 0.0037，计算x=0.0127，按公式计算活性： α-甘露糖苷酶酶活（U/g质量）= x×0.1÷W×F = 0.0127 U/mL