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产品基本说明:
α-GAL (EC 3.2.1.22)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,能专一地催化α-半乳糖苷键的水解,主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL对于植物种子的萌发至关重要,种子萌发初期,其催化产生的D-半乳糖通过糖酵解途径迅速转化和消耗,为种子的萌发提供Γ初的能量来源,后期则主要参与细胞壁储藏多糖水解。 α-GAL分解对-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚,后者在400nm有Γ大吸收峰,通过测定吸光值升高速率来计算α-GAL活性。 |
α-半乳糖苷酶(α-GAL)活性检测试剂盒(可见分光光度法)
产品货号:BA1013
产品规格:50管/24样
产品简介:
α-GAL (EC 3.2.1.22)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,能专一地催化α-半乳糖苷键的水解,主要参与棉子糖、水苏糖、蜜二糖和半乳甘露聚糖等半乳糖苷的降解。α-GAL对于植物种子的萌发至关重要,种子萌发初期,其催化产生的D-半乳糖通过糖酵解途径迅速转化和消耗,为种子的萌发提供Γ初的能量来源,后期则主要参与细胞壁储藏多糖水解。
α-GAL分解对-硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚,后者在400nm有Γ大吸收峰,通过测定吸光值升高速率来计算α-GAL活性。
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
产品组成:
产品组成 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体50mL×1瓶 | 4℃ |
试剂一 | 粉剂×1瓶 | -20℃ |
试剂二 | 液体15mL×1瓶 | 4℃ |
试剂三 | 液体80mL×1瓶 | 4℃ |
标准品 | 液体1mL×1支 | 4℃ |
溶液的配制:
1. 试剂一:临用前每瓶加入5mL双蒸水,充分溶解备用;用不完的试剂仍-20℃保存;
2. 标准品:5μmol/mL的对硝基苯酚溶液。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤(仅供参考):
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 细菌或培养细胞的处理:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每1000万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率20%,超声3s,间隔10s,重复30次),15000g,4℃,离心20分钟,取上清,置冰上待测。
2. 组织的处理:称取约0.1g组织,加入1mL提取液进行冰浴匀浆;15000g,4℃,离心20min,取上清,置冰上待测。
二、测定步骤
1. 分光光度计预热30min以上,调节波长至400nm,蒸馏水调零。
2. 标准液的处理:用蒸馏水将标准液稀释至200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/mL。
3. 样本测定(在1.5mLEP管中依次加入下列试剂)
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 | 标准管 |
试剂一 | 200 | - | - |
蒸馏水 | - | 200 | - |
试剂二 | 250 | 250 | - |
样本 | 50 | 50 | - |
迅速混匀,放入37℃准确水浴30min | |||
标准液 | - | - | 500 |
试剂三 | 1000 | 1000 | 1000 |
充分混匀,室温静置2min后,400nm处测定吸光值A。ΔA=A测定管-A对照管。 |
三、α-GAL活性计算
1. 标准曲线的建立:
根据标准管的吸光度(y,各标准管吸光值减去浓度为零的标准管的吸光值)和浓度(x,nmol/mL)建立标 准曲线,将ΔA(y)带入标准曲线中,计算样本生成的产物量x(nmol/mL)。
2. α-GAL活性计算
(1)按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
α-GAL活力(U/mg prot)=(x×V反总)÷(V样×Cpr)÷T=20x÷Cpr
蛋白浓度需要另外测定。
(2)按样本质量计算
单位的定义:每g组织每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
α-GAL活力(U/g质量)=(x×V反总)÷(W×V样÷V样总)÷T=20x÷W
(3)按细菌或细胞数量计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
α-GAL活力(U/104 cell)=(x×V反总)÷(1000×V样÷V样总)÷T=0.02x
Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;V反总:反应体系总体积,0.5mL;V样:加入反应体系中样本体积,0.05mL;V样总:加入提取液体积,1mL;W:样本质量,g;1000:细胞或细菌总数,1000万;T:反应时间,0.5h。
产品介绍: