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产品基本说明:
淀粉酶负责水解淀粉,主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。β-淀粉酶(EC 3.2.1.2) 从淀粉的非还原端切开α-1,4糖苷 键,生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖。 还原糖还原3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质。α-淀粉酶不耐酸,β-淀粉酶不耐热。根据上述特性,钝化其中 之一,就可测出另一种淀粉酶的活力。 |
β-淀粉酶活性检测试剂盒(可见分光光度法)
产品货号:BA1025
产品规格:50管/24样
产品说明:
淀粉酶负责水解淀粉,主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。β-淀粉酶(EC 3.2.1.2) 从淀粉的非还原端切开α-1,4糖苷 键,生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖。
还原糖还原3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质。α-淀粉酶不耐酸,β-淀粉酶不耐热。根据上述特性,钝化其中 之一,就可测出另一种淀粉酶的活力。
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
产品内容:
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
试剂一 | 液体65mL×1瓶 | 室温 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | 4℃ |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃ |
溶液的配制:
1. 试剂一:若有黄色晶体析出,需加热溶解后再用。
2. 试剂二:临用前加入35mL蒸馏水,置于常温水中并加热至煮沸,期间不断搅拌粉剂至溶解。
3. 标准品:10mg无水葡萄糖。临用前加入1mL蒸馏水配制成10mg/mL的标准溶液。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、恒温水浴锅、离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
称取约0.1g样本,加入0.8mL蒸馏水,研磨匀浆;将匀浆倒入离心管中,提取液在室温下放置提取15min,每5min振荡1次,使其充分提取;6000g,常温离心10min,取上清液加蒸馏水定容至10mL,摇匀,即淀粉酶原液。
吸取上述淀粉酶原液1mL,加入4mL双蒸水,摇匀,即为淀粉酶稀释液,用于(α+β)淀粉酶总活力的测定。
二、测定步驟
1. 分光光度计预热30min以上,调节波长至540nm,蒸馏水调零。
2. 将10mg/mL葡萄糖标准液用蒸馏水稀释为0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/mL的标准溶液。
3. 取2支EP管分别加入250μL淀粉酶原液和淀粉酶稀释液,沸水浴5min,分别作为α-淀粉酶对照管和β-淀粉酶对照管使用。
4. 按操作表依次加入各试剂:
试剂名称(µL) | α-淀粉酶活力测定 | 总淀粉酶活力测定 | 标准曲线的测定 | |||
对照管 | 测定管 | 对照管 | 测定管 | 空白管 | 标准管 | |
淀粉酶原液 | 250(煮沸) | 250 | - | - | - | - |
蒸馏水 | - | - | - | - | 250 | - |
标准溶液 | - | - | - | - | - | 250 |
70℃水浴15min左右,冷却 | ||||||
淀粉酶稀释液 | - | - | 250(煮沸) | 250 | - | - |
试剂二 | - | 250 | - | 250 | - | - |
在40℃恒温水浴中准确保温5min | ||||||
试剂一 | 500 | 500 | 500 | 500 | 500 | 500 |
试剂二 | 250 | - | 250 | - | 250 | 250 |
混匀,沸水浴10min,在540nm下测定吸光度,从左到右分别记为A1、A2、A3、A4、A5和A6,计算ΔAα=A2-A1, ΔA总=A4-A3,ΔA标准=A6-A5。
三、酶活性计算
1. 标准曲线的绘制:以ΔA标准为y轴,以标准溶液浓度为x轴,绘制标准曲线,得到方程y=kx+b。将ΔAα测定带 入方程得到x1(U/mL),ΔA总代入方程得到x2(mg/mL)。
2. α-淀粉酶活性:
(1)按照样本质量计算
单位定义:每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
α-淀粉酶活性(U/g 质量)=x1×V样÷(W×V样÷V样总)÷T =2×x1÷W
(2)按照蛋白质含量计算
单位定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。
α-淀粉酶活性(U/mg prot)=x1×V样÷(V样×Cpr)÷T=0.2×x1÷Cpr
3. 总淀粉酶活性计算:
(1)按照样本质量计算
单位定义:每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
总淀粉酶活性 (U/g 质量)=5×x2×V样÷(W×V样÷V样总) ÷T=10×x2÷W
(2)按照蛋白质含量计算 单位定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
总淀粉酶活性(U/mg prot)=5×x2×V样÷(V样×Cpr)÷T=x2÷Cpr
4. β-淀粉酶活性计算:
(1)按照样本质量计算
单位定义:每g组织在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
β-淀粉酶活性(U/g 质量)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=(10×x2÷W)-(2×x1÷W)=(10×x2-2×x1)÷W
(2)按照蛋白质含量计算
单位定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
β-淀粉酶活性(U/mg prot)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=(x2÷Cpr)-(0.2×x1÷Cpr)
5:总淀粉酶稀释倍数,(4mL+1mL)/1mL=5;V样:加入反应体系中样本体积,0.25mL;V样总:提取液总体积,10mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间,5min。
注意事项:
测定的吸光值大于1时,可以对样本进行适当稀释后测定。若吸光值过小,可以浓缩淀粉酶稀释液或者淀粉酶原液。
产品介绍: