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产品基本说明:
β-GAL(EC 3.2.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,能够催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷键水解,此外还具有转半乳糖苷的作用。β-GAL不仅可为植物的快速生长释放储存的能量,还能在正常的多糖代谢、细胞壁组分代谢以及衰老时细胞壁降解过程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖残基的水解,释放自由的半乳糖。 β-GAL分解对-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚,后者在400nm有Γ大吸收峰,通过测定吸光值升高速率来计算β-GAL活性。 |
β-半乳糖苷酶(β-GAL)活性检测试剂盒(可见分光光度法)
产品货号:BA1029
产品规格:50管/24样
产品内容:
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体50mL×1瓶 | 4℃ |
试剂一 | 粉剂×1瓶 | -20℃ |
试剂二 | 液体15mL×1瓶 | 4℃ |
试剂三 | 液体80mL×1瓶 | 4℃ |
标准品 | 液体1mL×1支 | 4℃ |
溶液的配制:
1. 试剂一:临用前每瓶加入5mL双蒸水,充分溶解备用;用不完的试剂仍-20℃保存。
2. 标准品:5μmol/mL的对硝基苯酚溶液。
产品说明:
β-GAL(EC 3.2.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,能够催化β半乳糖苷化合物中β半乳糖苷键水解,此外还具有转半乳糖苷的作用。β-GAL不仅可为植物的快速生长释放储存的能量,还能在正常的多糖代谢、细胞壁组分代谢以及衰老时细胞壁降解过程中催化多糖、糖蛋白以及半乳糖脂末端半乳糖残基的水解,释放自由的半乳糖。
β-GAL分解对-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷生成对-硝基苯酚,后者在400nm有Γ大吸收峰,通过测定吸光值升高速率来计算β-GAL活性。
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);15000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2. 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液),进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
二、测定步骤:
1. 分光光度计预热30min以上,调节波长至400nm,蒸馏水调零。
2. 标准液的处理:用蒸馏水将标准液稀释至200、100、50、25、12.5、6.25、0nmol/mL。
3. 样本测定(在EP管中依次加入下列试剂):
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 | 标准管 |
试剂一 | 200 | ||
蒸馏水 | 200 | ||
试剂二 | 250 | 250 | |
样本 | 50 | 50 | |
迅速混匀,放入 37℃准确水浴30min | |||
标准液 | 500 | ||
试剂三 | 1000 | 1000 | 1000 |
充分混匀,400nm处测定吸光值A,计算ΔA=A测定-A对照。每个测定管需设一个对照管。 |
三、β-GAL活性计算:
1. 标准曲线的建立:
根据标准管的吸光度(x,减去浓度为0的标准管OD值)和浓度(y,nmol/ml)建立标准曲线, 将△A带入标准曲线中,计算样品生成的产物量(nmol/ml)。
2. β-GAL活性计算:
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每mg组织蛋白每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GAL活力(nmol/h /mg prot)=(y×V反总)÷(V样×Cpr)÷T
=20×y÷Cpr
蛋白浓度需要另外测定。
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GAL活力(nmol/h /g鲜重)=(y×V反总)÷(W×V样÷V样总)÷T
=20×y ÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
β-GAL活力(nmol/h /104 cell)= (y×V反总)÷(500×V样÷V样总)÷T
=0.04×y
Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;V反总:反应体系总体积,0.5mL;V样:加入反应体系中样本体积,0.05mL;V样总:加入提取液体积,1mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万;T:反应时间,0.5h。
产品介绍: