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产品基本说明：
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GCL（glutamate cysteine ligase）是GSH合成的限速酶，GSH对GCL有反馈抑制作用。GCL基因表达受多种因素调节，如氧化剂、抗氧化剂、生长因子和炎症因子等。GCL活性高低对GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影响。 在ATP和Mg2+存在下，GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸；同时ATP去磷酸化产生无机磷分子，通过测定无机磷增加速率，即可计算出GCL活性。 |
γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCL）活性检测试剂盒
（可见分光光度法）
产品货号：BA1031
产品规格：50管/24样
产品内容：
试剂一：液体40mL×1瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存。临用前加14mL蒸馏水充分震荡溶解，用不完的试剂-20℃分装保存，禁止反复冻融。
试剂三：粉剂×1支，4℃保存。临用前加3.5mL蒸馏水充分震荡溶解。
试剂四：液体16mL×1瓶，4℃保存。
试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入30mL蒸馏水，充分震荡溶解后，缓缓加入1.0mL浓硫酸（自备），边加边搅拌。
标准品：液体1mL×1支，4℃保存。1μmol/mL磷标准溶液。
产品说明：
GCL（glutamate cysteine ligase）是GSH合成的限速酶，GSH对GCL有反馈抑制作用。GCL基因表达受多种因素调节，如氧化剂、抗氧化剂、生长因子和炎症因子等。GCL活性高低对GSH含量和GSH/GSSG比值有重要影响。
在ATP和Mg2+存在下，GCL催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸；同时ATP去磷酸化产生无机磷分子，通过测定无机磷增加速率，即可计算出GCL活性。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、冷冻离心机、水浴锅、移液器、1mL玻璃比色皿、浓硫酸和蒸馏水。
操作步骤：
一、粗酶液提取：
1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
3. 血清等液体：直接测定。
二、GCL测定操作：
1. 分光光度计或酶标仪预热30min，调节波长到660nm，蒸馏水调零。
2. 将标准液用蒸馏水稀释成0.1μmol/mL 磷标准溶液。
3. 加样表：
试剂名称（μL） | 对照管 | 测定管 | 标准管 | 空白管 |
试剂一 | 240 | 240 | ||
试剂二 | 260 | 260 | ||
试剂三 | 60 | 60 | ||
样本 | - | 120 | ||
混匀后盖紧，37℃水浴准确反应15min； | ||||
试剂四 | 300 | 300 | ||
样品 | 120 | - | ||
混匀后，室温（25℃左右）10000rpm，离心10min； | ||||
上清 | 500 | 500 | - | - |
磷标准品 | - | - | 500 | - |
蒸馏水 | - | - | - | 500 |
试剂五 | 500 | 500 | 500 | 500 |
混匀后盖紧，45℃水浴10min，冷却后测定660 nm处光吸收，尽快测完。计算ΔA测=A测定管-A对照管， ΔA标=A标准管-A空白管。 | ||||
三、GAL活性计算：
（1）按蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃下，每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol无机磷的GCL酶活量为1个酶活力单位。
GCL（U/mg prot）=[ΔA测÷（ΔA标÷C标准液）×V反总]÷(Cpr×V样)÷T
=0.0544×ΔA测÷ΔA标÷Cpr
（2）按样品鲜重计算
活性单位定义：37℃下，每克样品每分钟催化产生1μmol无机磷的GCL酶活量为1个酶活力单位。
GCL（U/g鲜重）=[ΔA测÷（ΔA标÷C标准液）×V反总]÷(W÷V样总×V样)÷T
=0.0544×ΔA测÷ΔA标÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：37℃下，每104个细胞每分钟催化产生1μmol无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。
GCL（U/104 cell）=[ΔA测÷（ΔA标÷C标准液）×V反总]÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T
=0.0544×ΔA测÷ΔA标÷细胞数量
（4）按照液体体积计算
活性单位定义：37℃下，每毫升液体每分钟催化产生1μmol无机磷的GCL酶活量为1个酶活单位。
GCL（U/mL）= [ΔA测÷（ΔA标÷C标准液）×V反总]÷V样÷T
=0.0544×ΔA测÷ΔA标
V反总：反应总体积，0.98mL；V样：加入样品体积，0.12mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；T：反应时间，15min，C标准液：磷标准溶液浓度，0.1μmol/mL；V样总：加入试剂一的体积，1mL；W：样品鲜重，g；细胞数量：以104为单位计算，万个。
注意事项：
（1）样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，以免影响其活力。如果是匀浆液，避免反复冻融。
（2）样本测定前先取1-2个样做预实验，如吸光值大于1，应先用试剂一(或者生理盐水)稀释到适当倍数，哺乳动物组织和血液一般稀释3～5倍。
（3）细胞中GCL活性测定时，细胞数目须在300万-500万之间，细胞中GCL的提取时可加试剂一（或生理盐水）后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。
（4）试剂三配制完成后，请一周内使用完。
（5）试剂五配制过程中，可能会产生黑色固体，其不影响结果，注意吸取时不要将黑色固体吸入。该溶液配制完成后应为浅黄色，若为蓝色则已污染，不可再使用。
（6）测定吸光值时请于水浴后10～40分钟内测完。
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