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产品基本说明:
γ-GT是γ-谷氨酰循环中的关键酶,催化GSH降解。γ-GT催化GSH或者其他γ-谷氨酰基化合物上的γ-谷氨酰基转 移到受体。也可以催化GSH和其他γ-谷氨酰基化合物的水解,产生谷氨酸盐,在细胞外谷胱甘肽新陈代谢中起了 重要的作用。 γ-GT催化谷氨酰对硝基苯胺中γ-谷氨酰基转移给N-甘氨酰甘氨酸,生成对硝基苯胺,在405nm有特征光吸收; 通过测定405nm光吸收增加速率,来计算γ-GT酶活性。 |
γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)活性检测试剂盒(微量法)
产品货号:BA1034
产品规格:100管/96样
产品说明:
γ-GT是γ-谷氨酰循环中的关键酶,催化GSH降解。γ-GT催化GSH或者其他γ-谷氨酰基化合物上的γ-谷氨酰基转 移到受体。也可以催化GSH和其他γ-谷氨酰基化合物的水解,产生谷氨酸盐,在细胞外谷胱甘肽新陈代谢中起了 重要的作用。
γ-GT催化谷氨酰对硝基苯胺中γ-谷氨酰基转移给N-甘氨酰甘氨酸,生成对硝基苯胺,在405nm有特征光吸收; 通过测定405nm光吸收增加速率,来计算γ-GT酶活性。
注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
产品内容:
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体100mL×1瓶 | 4℃ |
试剂一 | 粉剂×1瓶 | 4℃ |
试剂二 | 液体4.9mL×1瓶 | 4℃ |
试剂三 | 液体18.4mL×1瓶 | 4℃ |
溶液的配制:
工作液(在试剂一瓶中配制):临用前配制,把试剂二倒入试剂一瓶中,充分溶解(室温过低时可以40℃水浴促进溶解);然后把试剂三倒入试剂一瓶中,混匀后室温保存。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)
1. 细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);10000rpm 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2. 组织:称取约0.1g样本,加提取液1.0mL充分研磨,于4℃,10000rpm离心15min,取上清液待测。
3. 血清(浆):直接检测。
二、测定步驟
1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至405nm,蒸馏水调零。
2. 试剂二置于25℃(一般物种)或者37℃(哺乳动物)水浴中预热30min以上(保证无沉淀)。
3. 样本测定:
试剂(μL) | 空白管 | 测定管 |
蒸馏水 | 20 | - |
上清液/血清 | - | 20 |
工作液 | 180 | 180 |
混匀后于405nm测定10s时的吸光度,吹打混匀后测量130s时的吸光度,记为A1和A2。计算ΔA测定管=A测2测A1,ΔA空白管=A空2- A空1,计算ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管。
三、γ-GT活性计算
A、按96孔板计算:
1. 按样本蛋白浓度计算:
活性单位定义:25℃或者37℃中,每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为一个活性单位。
γ-GT(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×106×V反总÷(Cpr×V样)÷T=0.845×ΔA÷Cpr
2. 按样本质量计算:
活性单位定义:25℃或者37℃中,每克组织每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为一个活性单位。
γ-GT(U/g 质量)=ΔA÷(ε×d)×106×V反总÷(W÷V提取×V样)÷T=0.845×ΔA÷W
3. 按血清(浆)体积计算:
活性单位定义:25℃或者37℃中,每毫升血清每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为一个活性单位。
γ-GT(U/mL)=ΔA÷(ε×d)×106×V反总÷V样÷T=0.845×ΔA
4. 按细菌或细胞数量计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1μmol对硝基苯胺为一个活性单位。
γ-GT(U/104cell)=ΔA÷(ε×d)×106×V反总÷(500×V样÷V提取) ÷T=1.69×10-3×ΔA
V样:加入样本体积,0.02mL;V提取:加入提取液体积:1mL;T:反应时间,2min;Cpr:样本蛋白质浓度, mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞数量,500万细胞;ε:对硝基苯胺消光系数,9870L/mol/cm;d:96孔板光径,0.6cm;V反总:反应体系总体积,,2×10-4L;106:单位换算系数,1mol=106μmol。
B、按微量玻璃比色皿计算:
将上述计算公式中的d=0.6 cm改为d=1cm(比色皿光径)。
注意事项:
培养细胞中γ-GT活性测定时,细胞中γ-GT的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理,不能用细胞裂解液处理 细胞(防止因为蛋白质变性导致酶失活)。
产品介绍: