SAINT-BIO/尚宝生物 BA1026 β-淀粉酶活性检测试剂盒（微量法）

β-淀粉酶（β-AL）活性检测试剂盒（微量法） 产品货号：BA1026 产品规格：100管/48样 产品内容： 试剂一：液体35mL×1瓶，常温保存，若有黄色晶体析出，需加热溶解后再用； 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入20mL蒸馏水，置于常温水中并加热至煮沸，期间不断搅拌粉至 溶解。 标准品：粉剂×1支，10mg无水葡萄糖。 产品说明： 淀粉酶负责水解淀粉，主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。β-淀粉酶(EC 3.2.1.2) 从淀粉的非还原端切开α-1,4 糖 苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖。 还原糖还原 3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质。α-淀粉酶不耐酸，β-淀粉酶不耐热。根据上述特性，钝化其 中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。 需自备的仪器和用品： 可见分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、离心机、可调式移液器、96孔板/微量玻璃比色皿、研钵和蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 称取约0.1g样本，加入0.8mL蒸馏水，研磨匀浆；将匀浆倒入离心管中，提取液在室温下放置提取15min，每 5min振荡1次，使其充分提取；6000g，常温离心10min，取上清液加蒸馏水定容至10mL，摇匀，即淀粉酶原液。 吸取上述淀粉酶原液1mL，加入4mL双蒸水，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于（α＋β）淀粉酶总活力的测定。 二、测定操作表： 1、 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。 2、 将葡萄糖标准液稀释为1、0.5、0.25、0.1325、0.0625、0.03425、0.015625、0.0078 和0.0039mg/mL的标准溶 液。 3、 按操作表依次加入各试剂： 试剂名称 （μL） α- 淀粉酶活力测定 总淀粉酶活力测定 标准曲线的测定 对照管 测定管 对照管 测定管 空白管 标准管 淀粉酶原液 75 75 - - 蒸馏水 - 75 标准溶液 75 - 70℃水浴15min左右，冷却 淀粉酶稀释液 75 75 - - 试剂一 - - 试剂二 75 75 在40℃恒温水浴中准确保温5min 试剂一 150 150 150 150 150 150 试剂二 75 0 75 75 75 混匀，90℃水浴10min，在200μL至96孔板或微量玻璃比色皿中，在540nm下测定吸光度， 从左到右分别记为 A1、A2、A3、A4、A5和A6，计算ΔAα=A2-A1，ΔA总=A4-A3，ΔA标准=A6-A5。 酶活性计算： 1、标准曲线的绘制 以∆A标准为y轴，以标准溶液浓度为x轴，绘制标准曲线，得到方程y=kx+b。将∆Aα测定带入方程得到x1 （mg/mL），∆A总代入方程得到x2（mg/mL）。 2、α-淀粉酶活性 （1）按照样本质量计算 单位定义：每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。 α-淀粉酶活性(mg/g鲜重)=x1×V样÷(W×V样÷V样总)÷T =2×x1÷W （2）按照蛋白质含量计算 单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。 α-淀粉酶活性(mg/mg prot)=x1×V样÷（V样×Cpr）÷T = 0.2×x1÷Cpr 3、总淀粉酶活性计算 （1）按照样品质量计算 单位定义：每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。 总淀粉酶活性 (mg/g鲜重 )=5×x2×V样÷(W×V样÷V样总) ÷T=10×x2÷W （2）按照蛋白质含量计算 单位定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。 总淀粉酶活性(U/mg/mg prot)= 5×x2×V样÷（V样×Cpr）÷T = x2 ÷Cpr 4、β-淀粉酶活性计算 （1）按照样品质量计算 单位定义：每g组织在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。 β-淀粉酶活性（U/g鲜重）＝淀粉酶总活性－α-淀粉酶活性=（10×x2÷W）-（2×x1÷W） =（10×x2-2×x1）÷W （2）按照蛋白质含量计算 单位定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。 β-淀粉酶活性（U/mg prot）=淀粉酶总活性－α-淀粉酶活性 =（x2÷Cpr）-（0.2×x1÷Cpr） 5、总淀粉酶稀释倍数:V样：加入反应体系中样本体积，0.075mL；V样总：提取液总体积，10mL；Cpr：样本蛋 白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，5min。 注意事项： 测定的吸光值大于1.5时，可以对样本进行适当稀释后测定。